Microscopia

In microbiologia la microscopia è utilizzata per l'osservazione iniziale dei microbi (diagnostica diretta) e per la loro identificazione, preliminare o definitiva. La microscopia riveste inoltre fondamentale importanza in citologia ed istologia.

Tecniche di microscopia

A seconda del tipo di microrganismo da identificare (batterio, virus, parassita pluricellulare, micete) si possono utilizzare tecniche diverse.

• Nella microscopia ottica a campo chiaro, il campione è visualizzato grazie alla luce che passa direttamente dal condensatore al vetrino. Si può optare per diversi ingrandimenti: 10x (per visualizzare l'intero campione), 40x (utile per osservare microrganismi di grosse dimensioni), 100x (per osservare batteri, miceti e alcuni dettagli morfologici). Il potere di risoluzione della microscopia a campo chiaro (determinato dalla lunghezza d'onda della luce usata per illuminare il campione e dal suo angolo di entrata negli obiettivi) è il fattore limitante di questa tecnica: può arrivare al massimo a discriminare dettagli nell'ordine del decimo di micron, usando lenti a immersione in olio. Spesso sono usate delle colorazioni, dato che gli indici di rifrazione degli organismi e dello sfondo spesso sono simili e risulta difficile distinguere il campione.
• Nella microscopia a campo scuro, invece, viene usato un condensatore che impedisce alla luce trasmessa di illuminare direttamente il campione: questo è raggiunto dalla luce diffusa solo se obliqua e risulta stagliato su uno sfondo nero. Il potere di risoluzione è 10 volte maggiore di quello della microscopia a campo chiaro (arriva a distiunguere dettagli di 0,02 micron) e consente di identificare i batteri più sottili. L'inconveniente è che la luce non attraversa i campioni: è possibile quindi studiarne i contorni ma non la loro struttura interna.
• La microscopia a contrasto di fase ovvia a quest'ultima inconvenienza: infatti consente di esaminare i dettagli interni del campione in esame. Il principio di base è l'amplificazione delle differenze di fase di fasci paralleli di luce che attraversano oggetti di densità diversa: la luce in fase risulta più chiara di quella fuori fase. In questo modo si creano immagini tridimensionali del campione, permettendo analisi dettagliate delle sue strutture interne.
• Nella microscopia a fluorescenza i campioni vengono marcati con dei fluorocromi, ovvero composti che assorbono lunghezze d'onda nel campo dell'ultravioletto ed emettono energia con lunghezze d'onda nello spettro del visibile. Il microscopio usa speciali lampade a vapori di mercurio o di xenon che generano una lunghezza d'onda inferiore rispetto alla luce emessa dai microscopi ottici tradizionali (il potere di risoluzione è quindi maggiore).
• Infine nella microscopia elettronica si usano magneti al posto delle lenti per indirizzare un fascio di elettroni attraverso il campione, l'immagine verrà proiettata su uno schermo. Visto che la lunghezza d'onda del fascio di elettroni è molto corta, l'ingrandimento e la risoluzione miglioreranno (si potranno apprezzare dettagli minimi e si potranno osservare anche grossi virus). Esistono due tipi di microscopia elettronica: la microscopia elettronica a scansione (SEM), nella quale le particelle producono un'immagine tridimensionale "rimbalzando" sulla superficie del campione con un certo angolo di incidenza, e la microscopia ottica a trasmissione (TEM) in cui le particelle passano attraverso il campione.

Tecniche di colorazione dei preparati microbiologici

• Le colorazioni semplici consistono in un solo colorante (ad esempio cristalvioletto o blu di metilene) e di solito tingono il materiale cellulare aumentando il contrasto con lo sfondo. Una variante è l'inchiostro di china, che scurisce lo sfondo e non il preparato.
• Le colorazioni differenziali prevedono l'impiego di più di un colorante. Quella più utilizzata è il metodo di Gram, che fornisce indicazioni sulla presenza/assenza di batteri, la quantità assoluta di batteri presenti, la percentuale relativa di gram+ o gram-, la localizzazione cellulare dei batteri. Altri colorazioni differenziali sono: coloranti ferro-ematossilina o coloranti tricromici (per l'identificazione dei protozoi) o la colorazione di Wright-Giemsa (usata per identificare i parassiti del sangue).
• Le colorazioni acido-resistenti vengono usate per evidenziare l'acido-resistenza, sono basate sulla caratteristica che alcuni microrganismi trattengono il colorante primario anche quando vengono esposti ad agenti decoloranti (ad esempio un acido debole). La colorazione di Ziehl-Neelsen è una delle più usate e la più antica, richiede il riscaldamento del campione durante la colorazione. Una colorazione acido-resistente a freddo è ad esempio il metodo di Kinyoun.
• Infine le colorazioni fluorescenti si servono di anticorpi fluorescenti o di altri composti come l'arancio di acridina (usato per colorare batteri e funghi).
• COLORAZIONE DI GIMENEZ
• COLORAZIONE SHAFFER FULTON per le spore