La duplicazione del DNA

La duplicazione è il fenomeno di replicazione delle molecole di DNA. L’evento richiede diverse strutture e meccanismi per cercare di preservare le informazioni ereditarie. Esistono diversi riesci di mutazioni, ovvero errori di trascrizione: spesso le mutazioni sono potenzialmente dannose e quindi richiedono sistemi di correzione, ma sono anche la chiave per l’evoluzione.

Proprietà della duplicazione

La duplicazione possiede alcune caratteristiche peculiari. Gli studi hanno determinato che la replicazione del DNA è semiconserativa: da un’elica parentale, si formano due eliche ibride composte da un filamento padre e di un filamento figlio.

Le strutture della duplicazione

Per la duplicazione sono necessari dei primer, molecole responsabili dell’innesco della trascrizione. Per il DNA sono solitamente degli oligonucleotidi complementari alla porzione terminale del tratto da replicare. Oltre al primer, è necessario il filamento stampo, ovvero che il filamento di DNA sia stato aperto e svolto per permetterne la lettura. Infine è necessaria la DNA polimerasi, l’enzima responsabile della trascrizione.

La replicazione è discontinua

Il meccanismo di duplicazione è leggermente diverso tra procarioti ed eucarioti, ma presenta molti tratti comuni. Per la replicazione abbiamo un punto d’origine, dal quale si inizia ad aprire la doppia elica di DNA. A questo punto interviene la DNA polimerasi che inizia a replicare il filamento, in una direzione oppure in entrambi. L’enzima lavora sempre in direzione 5’-3’, quindi avremo una DNA pol che seguirà lo svolgimento del doppio filamento, ed una che viaggierà al contrario. In questo secondo caso, la sintesi procederà in modo discontinuo, formando i frammenti di Okazaki. Per esempio, Escherichia Coli (uno dei batteri maggiormente studiati) presenta il DNA circolare (procariota). Ad un certo punto abbiamo la comparsa di un punto specifico di origine, chiamato Ori C, dal quale va originandosi ed espandendosi la bolla di replicazione. La bolla si espande nella direzione delle forcelle di replicazione, la struttura responsabile di svolgere il DNA e mantenerlo aperto, per cui l’espansione può essere monodirezionale o bidirezionale. A questo punto, i primer si legano al DNA ed inviano l’enzima. Le DNA polimerasi sintetizzano il filamento rapido ed i frammenti di Okazaki, che verranno poi uniti attraverso l’enzima ligasi. Quando il DNA è completamente replicato, interverrà una proteina specifica (la RecA) a segregare i due DNA. Il sistema di replicazione è organizzato in un replisoma, che regola tutti i meccanismi di primasi, polimerasi, ecc.

DNA Polimerasi

La DNA pol è l’enzima che conduce tutta la replicazione del DNA. In E. Coli si è visto che sono presenti 3 tipi di polimerasi:

• Pol III, che è la responsabile diretta della sintesi di DNA
• Pol I e II, che hanno funzione di proofreading

La polimerasi non è in grado di iniziare la replicazione autonomamente, ma necessita di un primer a cui legarsi. Quando Pol III si lega ed inizia la replicazione, essa segue il filamento stampo appaiando le basi azotate complementari. Può capitare che la pol compia un appaiamento errato: in questo caso, la pol I interviene per la correzione. Questo è possibile perché la Pol I possiede una porzione chiamata frammento di Kleenov, caratterizzata da funzione esonucleasica 3’-5’ e funzione polimerica 5’-3’. Ciò le consente di tornare indietro e tagliare porzioni di filamento contenente l’errore. Il filamento contenente l’errore viene eliminato, si sintetizza un nuovo filamento corretto e gli enzimi legasi legano le due estremità del filamento.

Strutture ausialiarie alle DNA Polimerasi

Durante la replicazione, vengono impiegate le DNA clamp: sono fattori di promozione/processamento che hanno la funzione di “forzare” l’appaiamento di DNA polimerasi e filamento stampo. Il risultato è un aumento di efficacia (n° di appaiamenti e velocità) dell’enzima. Le DNA ligasi hanno la funzione di legare due frammenti di DNA. Vengono impiegati durante un intervento di riparazione e per legare i frammenti di Okazaki. La replicazione si interrompe quando la forcella incontra il complesso Tus-Ter. Il complesso funziona solamente una vola per direzione di replicazione, ed è in grado di intrappolare la forcella vietandone direzioni di movimento. Se sono presente due forcelle, la seconda si ferma quando incontra l’altra già intrappolata.

Danni al DNA: le mutazioni

L’appaiamento del DNA può compiere alcuni errori nel selezionare le basi da appaiare. Ciò genera una mutazione del codice genetico, ovvero delle informazioni contenute all’interno del DNA (la mancanza della sequenza corretta può portare alla mancata formazione di una proteina). A volte le mutazioni possono avvenire per eventi esterni:

• Deamminazione ossidativa: danni provocati dall’ossigeno che causano la perdita di una base azotata
• Danni provocati da radiazioni UV: un irraggiamento di potenza eccessiva può dar luogo a diversi errori, tra cui la formazione di ossoguanina, dimeri di timina, interazioni con agenti alchilanti, ecc.

Nel caso avvengano degli errori, spetta ai sistemi di proofreading riconoscervi ed attivare i meccanismi di correzione. Se invece l’errore non viene commesso, quando avviene la traduzione su RNA, la presenza della mutazione interrompe la sintesi proteica. La cellula attua diversi meccanismi per riparare un filamento di DNA danneggiato.

Riparazione per BER: escissione di basi

Il meccanismo prevede una riparazione delle basi che avvengono per escissione di basi (deamminazione, alchilasi). Gli enzimi DNA glicolasi rimuovono il legame glicosidico, staccando la base azotata (errata) dallo zucchero.

Riparazione per NER: escissione di nucleotidi

Per l’escissione dei nucleotidi, sono necessarie le Polimerasi e ligasi. Il meccanismo prevede la sintesi di nuovo filamento e la giunzione con il creato precedentemente.

Riparazione per NHEJ: non-homologous end-joyning

In questo meccanismo, due estremità vengono riunite senza il completamento delle informazioni contenute tra di loro. Questo meccanismo di riparazione è potenzialmente mutagenico.

Riparazione post-replicativa

Il meccanismo viene applicato quando non è disponibile il filamento di DNA stampo. I meccanismi impiegati sono la ricombinazione, che crea a completamente combinazioni identiche, oppure il meccanismo SOS, dove vengono replicate delle sequenze già presenti. Questi sistemi sono meno precisi ed affidabili. La ricombinazione genera il fenomeno del crossing-over. Attraverso il crossing-over, si creano alcuni punti di incrocio tra i due neofilamenti (frammenti di Holliday), che permette al ricombinazione delle informazioni contenuti tra di essi. il risultato è formazione di filamenti contenenti codice genetico proveniente dall’altra doppia elica. Il processo può interessare solo una coppia oppure entrambe le coppie del doppio filamento. La ricombinanzione è favorita dai fattori replicanti. Per i batteri, RecA è uno dei fattori più importanti. Ha la funzione di promuovere gli scambi tra le catene.